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PCRクローニングは従来のクローニングとは異なり、制限酵素を使用せずに目的のDNA断片、さらにはベクターをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅し、ライゲーションで結合することができる。

PCRクローニングは、遺伝子をクローニングするための迅速な方法であり、従来のクローニング法では対応できない高い処理能力を必要とするプロジェクトによく使用される。大量に入手できないDNA断片のクローニングが可能である。

通常、PCR反応により目的の配列を増幅し、形質転換前にブラントライゲーションまたは一塩基オーバーハングライゲーションによりベクターに結合させる。初期のPCRクローニングでは、遺伝子を増幅するためにTaq DNA Polymeraseがしばしば用いられた。この結果、ポリメラーゼの通常の作用により、PCR産物の3'末端にテンプレートに依存しない1つのアデニン（A）残基が付加されたPCR産物が得られる。これらの「A-tailed」産物は、次にT4 DNAリガーゼを用いて相補的なT-tailedベクターにライゲーションされ、その後、形質転換される。

高忠実度DNAポリメラーゼは現在、3'延長を含まないPCR産物で配列を増幅するためにも日常的に使用されている。鈍端断片は、典型的なライゲーション反応によって、あるいは共有結合した酵素、典型的にはトポイソメラーゼIを含む「活性化」ベクターの作用によってプラスミドベクターに結合され、ベクターとインサートの結合を促進させる。いくつかのPCRクローニングシステムは、PCR産物が形質転換中に組換え分子を取り込む株の増殖を可能にするためにうまくライゲーションされなければならない毒性遺伝子を含む工学的な「自殺」ベクターを含んでいる。

多くのPCRクローニング法に共通する典型的な欠点は、使用しなければならない専用ベクターである。これらのベクターは通常、NEBのようなサプライヤーからすぐに使える線形化されたフォーマットで販売されており、クローニングの総費用に大きな出費を強いることがある。また、特定のベクターを使用することで、抗生物質耐性、プロモーター、融合パートナー、その他の調節要素の選択が制限される。

利点
専用ベクターによる高い効率性
ハイスループットに対応

デメリット
ベクターの選択肢が限られる
コストが高い
接合部での配列制御ができない
マルチフラグメントクローニングは容易ではない
方向性を持ったクローニングが難しい

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