ｍRNAワクチンのスパイク発現量に関するお話
AKIRAです。
懲りずもワクチンのお話。
「発現量を制御する」ということの重要性
これは、実際に研究をやってみないと実感が湧きませんが、遺伝子の状態に関して普段から研究している研究者は、遺伝子発現の発現量に対して非常に敏感になります。
例えばiPS細胞の「iPSらしさ」は、iPS細胞を扱う実験において非常に大事になってくるポイントなので、「今培養しているiPS細胞は本当にiPS細胞の特性を維持できているのか？」を調べるために、NANOGやSOX2などのiPS未分化マーカー遺伝子の発現量を調べることで評価します。（もっと簡易的な方法もありますが）
そしてそれは、外から細胞に遺伝子導入した際も同じです。
研究の中身にもよりますが、導入した遺伝子が「どれだけ」「いつまで」発現するかという観点は、研究の目的を果たすために非常に重要なポイントになります。
これは、遺伝子の導入方法によらず、いかなる遺伝子導入法においても共通で実験を行う前にしっかりと検討する必要があります。
くどい前置きになりましたが、本日はこの遺伝子発現量を制御することが研究においてどれだけ重要視されているかのお話をしようかと思います。
Tet onシステム
かなり専門的な内容になりますが、実際の研究では「特定の期間だけ導入した遺伝子の発現をオンにして、任意のタイミングでオフにする」という技術があります。
それがTet onシステムというもの。
通常、細胞に外部から遺伝子を発現させようとする場合、方法としては上図のように環状（輪っか）にしたDNAであるプラスミド、もしくはmRNAを化学的な処理（細胞膜と電気的に親和性の高い物質で覆って細胞内に入れる）を用いて遺伝子発現を行います。
この時に、DNAプラスミドのほうでは、遺伝子発現のオン/オフができるシステムを組み込んだプラスミドがあります。
それがこちらのTet onシステム。
遺伝子発現をするだけならば、「プロモーター」と「発現させたい遺伝子の配列（インスリンとか）」と「転写の終末単位（ポリAなど）」で十分ですが、このシステムではプロモーターの前に「Tetオペレーター」と「tet応答型転写活性化因子」というものがついています。
これは、ドキソルビシン（Doxorubicin、以下Doxと表記）という抗生物質が存在しているとTetオペレーターに結合して遺伝子発現を促しますが、Doxがないと全く発現が起こらないようになるシステムです。
つまり、Doxを入れるとスイッチがオンになり、逆に除去するとスイッチがオフになるという代物です。
このシステムを利用することで、外部から導入した遺伝子の発現を自由にオン/オフできるわけです。
どういった時に利用されるか
よくあるのは、細胞の初期化（iPS細胞に誘導すること）で一時的に遺伝子の発現を行いたい場合や、遺伝子編集に使うCRISPRの技術で遺伝子変異を入れる酵素Casの発現を制御するときでしょうか。
前者は、iPS細胞へ誘導する際に、iPSになった後も遺伝子発現が続いていると不都合なことが起こることがある（例えばがん化とか）ため、発現調節の際に利用されます。（以下関連する研究例です。興味のある方はご覧ください）
後者のCRISPRに関しては、調べればいくらでも出てくるのですが、通常Cas酵素は発現が長引いてしまうと、狙ったところとは関係のない部位に変異を入れてしまうことがあります。これをオフターゲット効果といいます。
Tet onシステムでは、Doxを除去すれば発現をオフにできるので、Cas酵素が出続けるということにはなりません。よって、オフターゲットを抑えることができるわけですね。
また、Cas酵素はずっと発現させておくと、やがて発現しなくなっていきます。このような現象をサイレンシングというのですが、別にCas酵素に限った話ではなく、たいていは遺伝子を発現させているプロモーターに原因があることが多いです。この現象は、細胞生理学上起こりうる制御できない現象なので、Tet onシステムのように「ここぞ」というポイントに絞って発現する期間を限定してあげる必要があるわけです。
mRNAワクチンのRNA構造
modRNAと天然のmRNAの相違点
さて。ここまでは遺伝子発現の調節がいかに大事かを語りましたが、ここでRNAワクチンに含まれる主成分であるmRNAの構造を見てみましょう。
上図にもある通り、遺伝子導入されるmRNAには目的の遺伝子（今回はスパイク遺伝子）を非翻訳領域が挟み込んでおり、そのさらに両脇をキャップとポリAの構造が挟み込むという構造になっています。
RNAはタンパク質を合成するための翻訳情報体なので、プロモーターがなくともタンパク質合成が可能です。ただし、翻訳の開始点と終点がないと翻訳するべき領域が分からなくなるため、非翻訳領域には翻訳開始点と終点を決める配列があります。それ以外でmRNAに必要な構造は、RNAが分解されないような構造になります。キャップとポリAという構造は「ふたをする」役割があります。
ただ、ここまでの単なる構造自体は天然のmRNAと同じ構造ですが、ワクチンのRNAにしかないものがあります。それが塩基修飾です。本来のRNAを構成する情報媒体である塩基の一つ、U（ウラシル）が天然では合成されないシュードウリジンという修飾された塩基に置換されているという点です。
メチル化やアセチル化といった天然の現象で起こる修飾とは異なり、この修飾塩基は塩基の構造そのものも変化させています。
当然ながら、細胞内免疫はこれをウラシルとは認識しません。
しかし、通常のRNAと同じでタンパク質の情報体である役割は担うというとんでもない代物です。
塩基配列を認識できないことの何がまずいのか
突然ですが、皆さんは普段の生活で必ず「ごみ」が発生すると思います。
ごみはゴミ箱へ。
公園などでそんな張り紙を見たことがあると思います。
生活ごみが発生すれば、そのごみはゴミ箱へと捨てられ、ごみ箱の中身は収集車で回収され運ばれた後、焼却場にて処分されると思います。
mRNAも同じです。
タンパク質を合成し終えたmRNAはゴミになります。
放っておけば、さらなるタンパク質を作り続けることになるのです。
細胞はちゃんと使用されたmRNAを処分するための機能を持っているわけです。そのためには、「それがmRNAである」と細胞が認識している必要があります。
しかし先述のとおり、塩基修飾されたmRNAは分解されにくい構造になっており、その方法はmRNAであるという認識をごまかすことによって達成されています。
つまり、「ごみをごみと認識できなくされている」わけです。
ごみが放置されるとそれがナマモノであった場合、時間の経過とともに腐っていき悪臭を放ちます。やがて、害虫も住み着くでしょう。
modRNAを細胞に導入するということはそういうことです。
スパイク遺伝子はヒトゲノム上に存在しない
「でもワクチン以外の実験ではmRNAが細胞に導入されても細胞はなんともないじゃん」
そう思われている方もいらっしゃるかもしれません。
しかしそれは、あくまでも遺伝子発現の目的が、一時的であることが前提です。しかも、たいていそういうときは、mRNAのコードしている遺伝子が細胞のゲノム上に存在する遺伝子の場合のみ有効です。
ちなみにGFPのような蛍光タンパクはヒトゲノム上にはありませんが、マーカーや遺伝子導入がうまくいっているかの確認に利用されるため例外です。
では逆にヒトゲノム上に存在しない遺伝子をmRNA導入で培養細胞に発現させて放っておいた場合どうなるか？
答えは、「mRNAが分解されるまで遺伝子発現が継続する」です。
DNAであれば、プロモーターの制御があるので少し残っても発現が収まることもありますが、mRNAは残存すれば理論上同じRNAからいくらでもタンパク質を合成できるので、発現を止めたければ意図的にRNAを分解するシステムを構築する必要があります。
以前に私の記事でも紹介しましたが、人間の細胞のゲノムには、転写（DNA→RNAの反応）後のタンパク質発現を制御する機構が存在します。microRNA（miRNA）というもので、タンパク質を作る情報源のmRNAの翻訳（RNA→タンパク質の反応）を阻害する役割を持ちます。
しかし、miRNAは遺伝子発現のブレーキ役なので、ブレーキをかける遺伝子がゲノム内に存在していなければなりません。逆を言えば、ゲノム上に存在しない遺伝子のmiRNAは存在しません。例えば心臓の不整脈の原因となる遺伝子に対するmiRNAはゲノム内に存在します。（下記リンク参照↓）
しかし、GFPなどのヒトが持っていない遺伝子だとmiRNAがないので制御が効きません。したがって、mRNAの状態にもよりますが、仮にヒトの細胞でGFPを発現するmRNAを導入した場合、mRNAが完全分解されるまでGFPは発現し続けます。つまり緑色に光り続けるわけです。
https://new.jhrs.or.jp/pdf/education/koredakewa05.pdf
当然、スパイクはヒトゲノム上に存在しない遺伝子なので、制御なんかかかりません。ブレーキなんてないです。
これらはすべて遺伝子発現関連の基礎知識
そして、これらの知識はすべて学部生の卒業研究レベルの知識なので、同じ専攻分野の修士・博士レベルではほぼ常識です。
論文？
わざわざ必要ですか？
